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        技術支持

        比較核酸電泳中探針法和染料法的區別
        發布時間:2022-03-11   點擊次數:171次

        TaqMan探針法

        TaqMan探針法是高度特異的定量PCR技術,其核心是利用Taq酶的5'-3’外切核酸酶活性,切斷探針,產生熒光信號。由于探針與模板是特異性結合,所以熒光信號的強弱就代表了模板的數量。在TaqMan探針法的定量PCR反應體系中,包括一對PCR引物和-條探針。探針只與模板特異性地結合,其結合位點在兩條引物之間。探針的5端標記有報告基團(Reporter, R),如FAM、VIC等 ,3端標記有熒光淬滅基團(Quencher, Q) ,如TAMRA等。當探針完整的時候,報告基團所發射的熒光能量被淬滅基團吸收,儀器檢測不到信號。隨著PCR的進行, Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結合的探針,其3'→5'外切核酸酶活性就會將探針切斷,報告基團遠離淬滅基團,其能量不能被吸收,即產生熒光信號(如下圖)。所以,每經過一個PCR循環,熒光信號也和目的片段樣,有個同步指數增長的過程。信號的強度就代表了模板DNA的拷貝數。

        taqman.png


        SYBR Green I染料法

        SYBR Green I熒光染料技術原理SYBR Green I是-種只與DNA雙鏈結合的熒光染料(如下圖) 。當它與DNA雙鏈結合時,發出熒光;從DNA雙鏈上釋放出來時,熒光信號急劇減弱。因此,在一個體系內,其信號強度代表了雙鏈DNA分子的數量k。 SYBR Green熒光染料法定量PCR的基本過程是:

         1、開始反應,當SYBR Green染料與DNA雙鏈結合時發出熒光。

        2、DNA變性時,SYBR Green染料釋放出來,熒光急劇減少。

        3、在聚合延伸過程中,引物退火并形成PCR產物。

        4、聚合完成后,SYBR Green染料與雙鏈產物結合,定量PCR系統檢測到熒光的凈增量加大。

        sybr.png


        如何做選擇:

        SYBR Green熒光染料能與所有的DNA雙鏈相結合,對DNA模板沒有選擇性,所以特異性不如TaqMan探針。要想用熒光染料法得到比較好的定量結果,對PCR引物設計的特異性和PCR反應的質量要求就比較高。在此前提下,本法是-種成本低廉的選擇。


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